**一、细胞培养条件**

细胞名称: 生长特性: 贴壁生长

冻存条件: 无血清冻存液

培养体系: 1640 + 10% FBS + 1% P/S + 1% 丙酮酸钠 + 1% L-谷氨酰胺

传代方法: 初次建议1:2传代

传代情况: 2天更换培养基

备注: 请使用无菌离心管收集培养基，作为过渡对比培养；如对比效果不佳，建议直接选用我们的918博天堂完全培养基。

**二、细胞处理步骤**

收到细胞后，请将其培养至良好状态，灌满完全培养液，并确保瓶口密封，这是运输细胞的最佳方法。

收到细胞后，使用75%酒精喷洒整个细胞瓶，进行消毒后放入超净台内进行严格无菌操作。将细胞瓶置于37℃、5% CO2的培养箱中静置3-4小时，以稳定细胞状态再进行后续处理。

通过显微镜观察细胞生长情况，并对细胞进行不同倍数拍照保存（最好40x、100x、200x各一张），前三天的照片是重要的售后依据，如未提供照片，默认收到状态良好。传代后，建议一瓶使用原瓶的完全培养基，另一瓶使用自配的完全培养基，以便进行比较培养，换液后请松开瓶盖。

**三、细胞培养步骤**

a. 细胞传代：当细胞汇合度未超过80%时，请将完全培养液收集至离心管中，留5ml完全培养基，放入37℃、5% CO2孵箱进行培养；当细胞密度超过80%时，即可进行传代培养，具体步骤如下：

1. 弃去培养上清，使用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1-2ml至培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，显微镜下观察细胞消化情况；若细胞变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻轻敲击培养瓶，加入5ml以上的完全培养基终止消化。
3. 轻轻吹打细胞，使其完全脱落后吸出，将悬液转移至离心管中，在1000 RPM下离心5分钟，弃去上清液，补加1-2ml完全培养基重悬细胞。
4. 根据1:2的比例进行分瓶传代（两个T25瓶），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。

b. 细胞冻存：

1. 当细胞生长至覆盖培养瓶的80%面积时，弃去培养液，用PBS清洗细胞一次。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶中，观察细胞情况；待细胞缩减少并变圆时，加入5ml完全培养基终止消化，轻轻吹打细胞使其脱落，然后将悬液转移至15ml离心管中，1000 RPM离心5分钟。
3. 弃去上清液，沉淀细胞后加入1ml的918博天堂无血清冻存液（货号：C7001），混匀后加入冻存管中。
4. 将冻存细胞直接放入-80℃冰箱存储；如需转入液氮罐中，需在-80℃冰箱中存放24小时以上后再转入液氮罐中。

细胞复苏：从液氮中取出细胞冻存管（注意佩戴防护面具），迅速置入37℃水浴中解冻，直至冻存管中无结晶。擦拭冻存管外壁后，将细胞移至含有5ml完全培养基的15ml离心管中，1000 RPM离心5分钟。弃去上清，沉淀后用5ml完全培养基重悬，接种至T25培养瓶中，放置于37℃、5% CO2培养箱中培养；第二天，更换新鲜完全培养基继续培养。

**注意事项：**某些细胞可能在运输过程中因贴壁不牢而发生脱落，这是正常现象。如果细胞脱落较多，可以将培养瓶中的培养液收集至离心管，收集上清作过渡培养，后续再使用胰酶处理细胞。

**四、售后条款：**

1）可重发的情况及判定标准：

1. 细胞在运输过程中遇到各种问题（如细胞丢失、瓶身破损、培养液严重泄漏等）可重发；
2. 细胞污染问题，请在收到产品48小时内提供真实实验结果，验证后可重发；
3. 常温发货的细胞静置24小时后，干冰运输的细胞复苏后24小时内大部分细胞未存活（需提供真实清晰的细胞状态照片），可重发；
4. 干冰运输后24小时或常温发货静置4小时未经开封且出现污染，可重发；
5. 关于细胞活性问题，请在收到产品7天内提供真实实验结果，使用台盼蓝染色法鉴定细胞活力，核实后可重发；
6. 细胞收到当日及第2、3天请拍照，若3天内未告知问题，则视为产品合格。4-7天内如出现问题并提供细胞照片及操作详细步骤，经过技术人员确认如属我方责任，方可重发。技术人员判定为双方责任时，将协商解决或按合同价的50%进行重发。

2）不予以重发的情况：

1. 因客户造成的细胞污染，不予重发；
2. 因客户不当操作导致细胞状态不佳，不予重发；
3. 非本库推荐的培养体系导致的细胞问题，不予重发；
4. 未提供细胞培养前3天照片的，不予重发；
5. 细胞在培养过程中经历其它处理的，不予重发；
6. 细胞收到2天内未告知的，不予重发；
7. 以上情况将根据具体情况审定。